斑点叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）是从国外引进的一种重要的特种水产养殖鱼类，深受消费者青睐。但随着养殖规模的不断扩大和集约化程度日益提高，养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，其中由斑点叉尾鮰疱疹病毒（channel catfish virus，CCV）引发的斑点叉尾鮰疱疹病毒病（channel catfish virus disease， CCVD）危害最大。CCVD的暴发造成鱼苗、鱼种的死亡率高达90%以上，且无有效的治疗方法，给斑点叉尾鮰的养殖生产造成了巨大的经济损失。大量研究表明，环孢素A（CsA）对多种病毒的增殖具有抑制作用，而关于CsA对CCV的作用尚未见报道。本研究通过体外实验研究CsA对CCV增殖的影响，以期为防治斑点叉尾鮰疱疹病毒病提供重要的实验依据和参考资料。

1 材料与方法

1.1 细胞与培养

斑点叉尾鮰卵巢细胞系（channel catfish ovary cell，CCO）由华中农业大学水产学院提供。CCO细胞用含10% FBS的DMEM培养基在280C含5% CO2的培养箱中培养。通常2～3d传代1次，将细胞用PBS洗1次，在每个T25培养瓶中加入1ml的胰酶消化1min左右，随后再将胰酶除去，最后再添加含有10% FBS的DMEM培养基15毫升，将细胞吹散，摇匀分到3个T25培养瓶中培养。

1.2 病毒与感染

CCV病毒由华中农业大学水产学院提供。待CCO细胞生长状态良好时，以适当比例传代于大瓶中培养，24h内进行CCV的感染，首先吸去瓶中的细胞培养液，然后将细胞用无胎牛血清的DMEM细胞培养液清洗一遍，随后吸去没有用的废液，然后向细胞内加入稀释过107倍的CCV悬液0.5毫升，使液体覆盖细胞培养面，280C孵育1h，期间每隔20min轻摇晃一次使液体完全覆盖细胞培养面，之后吸弃CCV悬液，加入含5%胎牛血清的DMEM培养基，置于28℃培养、增殖，随后在显微镜下观察，当细胞完全病变后就放入-800C下保存。

1.3 抑制剂（CSA）的配制及其细胞毒性检测

将CSA粉末溶入DMSO中配制成不同的浓度分开装好后置于-200C冰箱中保存。在96孔板上接种CPB细胞，当细胞长到单层时，更换含有不同浓度CsA的培养液（0、2.5、5、10 、20、40μmol/L），在培养12h、24h、36h、48h和72h后用MTS法分别检测其细胞活性。

1.4  CSA对CCV病毒增殖的影响

在24孔细胞培养板上接种CCO，当细胞生长至55%左右融合时，就开始加入含不同浓度CSA培养基，同时设立DMSO为对照组，CsA作用12h后接种1 MOI 的CCV，吸附完成后换入含不同浓度CsA的培养基，CCV感染后72h收取样品。用TCID50法检测病毒滴度。

1.5  CsA对CCV诱导的细胞因子表达的影响

将CCO细胞接种于6孔细胞培养板中，等细胞长到50%~60%融合时，换入含有CsA的细胞培养液，同时设立DMSO为对照组。CsA作用12h后接种1 MOI 的CCV。另设一组接种无血清的DMEM培养基，作为正常细胞对照组。感染后12h、24h、36h和48h收取样品，加入TRizol试剂裂解，置于-80℃保存备用。

1.6 实时荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol试剂盒提取总RNA，按说明书进行。反转录使用PrimescriptR RT reagent Kit  With gDNA Eraser试剂盒，每个样品使用1μg总RNA进行反转录。使用SYBR染料法（Takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒）进行相对定量PCR，以斑点叉尾鮰的18s rRNA作为内参，用△△CT法计算，以全培养基组作为100%。使用ABI 7,500荧光定量PCR仪，反应条件为：首先95℃ 30s进行预变性；随后进行40个循环，反应为95℃ 5s，60℃ 34s。扩增反应完成后，进行溶解曲线分析，以确定引物的特异性。实验所用引物见表1。

表1   qRT-PCR引物


2  结果与分析

2.1不同浓度CSA对CCO细胞毒性检测

从图1中可以看出，当CsA的浓度小于等于10μmol/L的时候，在各个时间点对CCO细胞的活力均无显著影响。因此，后续研究中使用CsA的最大浓度为10μmol/L。

图1 MTS法检测CsA对CCO细胞的毒性

2.2  CSA对CCV病毒增殖的影响
从图2中可以看出，CsA浓度在0到10μmol/L之间，随着细胞中添加的CSA浓度的增加，细胞被病毒感染的感染率在不停降低，说明CsA对CCV的增殖起着抑制作用。

图2 不同浓度CsA对CCV增殖的影响

2.3  CsA对CCV诱导的细胞因子表达的影响

CCV的感染会诱导宿主的先天性免疫反应，导致宿主的一些细胞因子的表达发生变化，为研究CsA 对CCV感染后的细胞因子表达的影响，于感染后的6h、12h、24h、36h、48h和72h分别收样，用qRT-PCR方法检测CPB细胞中细胞因子的变化。结果表明，CsA对CCV感染后诱导的IL-8和TNF-α的表达均有抑制作用（图3，图4）。

图3 CsA对CCV感染后细胞中IL-8表达的影响

图4  CsA对CCV感染后细胞中TNF-α表达的影响

3  讨论

环孢素A（CsA），是一种使用广泛、作用强效的免疫抑制剂，可以特异和可逆地作用于淋巴细胞，抑制淋巴细胞的激活和增殖，抑制某些细胞相关的炎症因子的产生和释放，从而起到抑制细胞免疫的作用。CsA是由11个氨基酸组成的多肽。CsA进入细胞后先与CypA形成复合物（CypA-CsA），再与钙调磷酸酶（calcineurin，CN）结合，抑制CN酶活性，从而使其底物—激活的T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NF-AT）不能去磷酸化，抑制了NF-AT从胞浆进入细胞核内形成转录复合体，进一步抑制IL-2、IL-4、γ-干扰素等细胞因子的转录。CsA通过在转录水平上通过阻断T细胞的活化，从而实现免疫抑制效果。

关于CsA对病毒增殖的抑制作用已有很多的研究报道。Kim等对猪流行性腹泻病毒（PEDV）研究发现，CsA能抑制PEDV诱导的细胞凋亡，进而抑制PEDV的增殖。CsA 对多种冠状病毒的增殖都有抑制作用。CsA通过调节干扰素途径的关键因子的表达，促进I型干扰素的先天性免疫功能，从而抑制轮状病毒的复制。在对甲型流感病毒和丙型肝炎病毒等研究中，也有类似的结果[10,11]。胡先勤等研究表明，CsA可以显著抑制鳜鱼虹彩病毒（ISKNV）的增殖。本文的研究结果表明，CsA也能显著抑制CCV的增殖，有关于其作用机理需要进行进一步研究。

病毒感染会诱导细胞产生炎症反应，本文研究结果表明，CsA对CCV感染后诱导的IL-8和TNF-α的表达有抑制作用。提示CsA对CCV感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用，可能在相关信号通路中发挥重要作用，有关其具体机制需要进一步研究。

由于CsA对CCV的增殖具有显著的抑制作用，由此推测CsA及其衍生物将来可以作为防治CCV的候选药物。